کشت بافت[۱۶] اصطلاحی است که برای نشان­دادن کشت درون­شیشه ­ای بخش­های مختلف گیاهی در شرایط ضدعفونی شده به کار می­رود. این تکنیک در ازدیاد نباتات و اصلاح گیاه، تولید زیست توده، تولید فرآورده ­های بیوشیمیایی، بیماری­شناسی گیاهی، نگه­داری و انبار کردن بافت­های گیاهی، پژوهش­های علمی و غیره کاربرد دارد. اصطلاح بیوتکنولوژی در برگیرنده همه این فعالیت­ها می­ شود. اصطلاح ریزازدیادی[۱۷] به طور اختصاصی به کاربرد تکنیک کشت بافت برای تکثیر گیاه با بهره گرفتن از بخش­های کوچکی از گیاه که در شرایط ضدعفونی شده در لوله آزمایشگاه یا ظرف­های دیگر پرورش می­یابند، مربوط می­ شود. در عمل، بسیاری از تولیدکنندگان گیاهی اصطلاح “ریزازدیادی” و “کشت بافت” را مترادف هم به کار می­برند تا هر شیوه ازدیاد گیاه در شرایط ضدعفونی شده را، توصیف کنند. واژه مترادف دیگر، “کشت درون شیشه ای”[۱۸] می­باشد (خوشخوی، ۱۳۸۲). کشت بافت امکان تکثیر سریع تعداد زیادی از گیاهان یکنواخت در حالیکه ژنوتیپ خودشان را حفظ کرده اند، فراهم می­ کند (Arikat et al., ۲۰۰۴). کشت بافت گیاهی بر پایه سه قابلیت گیاهی استوار است ؛ ۱- توانمندی[۱۹]، که توان یا ظرفیت توارثی یک سلول گیاهی برای نمو به یک گیاه کامل با القای تحریک مناسب است. توانمندی بر این مطلب دلالت می­ کند که هر سلول واجد تمام اطلاعات لازم برای رشد و تکثیر می­باشد. گرچه از لحاظ نظری همه سلولهای گیاهی توانمند هستند، با این حال سلول­های مریستمی بیشترین توان بیان این ویژگی را دارند. ۲- تمایز زدایی[۲۰]، که توان سلولهای بالغ برای بازگشت به شرایط مریستمی است و بعد از آن سلول­ها با بازتمایزی[۲۱] ، اندام­های جدیدی را سازماندهی می­ کنند. ۳- شایستگی[۲۲]، که توانایی ذاتی یک سلول یا بافت گیاهی را برای نمو در یک مسیر مشخص بیان می­ کند (عادلی مسبب، ۱۳۷۸).
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۸-۱- اهمیت و کاربرد کشت بافت در باغبانی
تولید گیاهان عاری از ویروس و بیماری.
تکثیر و ریزازدیادی گیاهان .
تولید گیاهان هاپلوئید و سپس دیپلوئید کاملا هموزیگوس از طریق کشت میکروسپور یا بساک.
دست­ورزی ژنتیکی و دورگ­گیری سوماتیکی با بهره گرفتن از الحاق پروتوپلاسمی و همچنین ایجاد تلاقی بین گونه ­ای در شرایط درون­شیشه ای.
کشت سوسپانسیون سلولی و تولید متابولیت­های اولیه مثل قند و کربن و نیز متابولیت­های ثانویه.
ایجاد گیاهان با خصوصیات جدید با بهره گرفتن از تنوع سوماکلونال.
نجات جنین با بهره گرفتن از کشت جنین­های نارس در تلاقی بین گونه ­ای.
نگهداری ژرم پلاسم گیاهان در شرایط درون­شیشه ای.
استفاده از کشت بافت در انتقال ژن به گیاهان.
استفاده در مطالعات بافت­شناسی، سلول­شناسی و فیزیولوژی گیاهی (اثنی عشری، ۱۳۸۸).
۹-۱- اهمیت و کاربرد کشت بافت در گیاهان دارویی
در حال حاضر بیش از پنجاه هزار گونه گیاهی درگیاه­ درمانی و به عنوان دارو استفاده می­ شود. تقریباً دو سوم آنها از طبیعت برداشت می­شوند که منجر به انقراض محلی گونه­ های زیادی از گیاهان یا کاهش محل سکونت آنها شده­است. روش های بیوتکنولوژی نه تنها امکان تولید سریعتر و محافظت از ژنوتیپ­های گیاهی را ارائه می­ کند، بلکه برای تغییر و تبدیل اطلاعات ژنی آنها، تنظیم و بیان ژن برای تولید مواد گیاهی با ارزش در مقادیر زیاد و یا با خواص بهتر، راهکارهایی را پیشنهاد می­دهد (Tasheva and Kosturkova, 2011).
کشت گیاهان دارویی به منظور استخراج ترکیبات فعال ممکن است با محدودیت­های خاصی مانند آب و هوا، فصل، آب در دسترس، بیماریها، آفات و کمبود گیاهانی که به طور طبیعی رشد یافته­اند، مواجه شود. چنین محدودیت­هایی به استفاده از تکنیک­های کشت بافت برای تولید ترکیبات فعال منجر شده­است (Arikat et al., 2004). ریز ازدیادی درون شیشه ­ای، یک روش مؤثر برای تکثیر گونه ­هایی است که نیاز به یکنواختی زیاد در نتاج دارند، بنابراین علاقه به استفاده از این تکنیک­ها برای تکثیر سریع گیاهان دارویی و معطر در مقیاس بزرگ به طور قابل توجهی افزایش یافته­است (Sahoo et al., ۱۹۹۷). فواید استفاده از کشت بافت به منظور استخراج متابولیت­های ثانویه عبارتند از: عدم استفاده یا استفاده کمتر از گونه های وحشی در معرض خطر انقراض، تولید متابولیت­های ثانویه خارج از فصل و شرایط آب و هوایی مناسب و تولید سریع متابولیت­های ثانویه به علت رشد سریع در شرایط درون شیشه ­ای (Pierik, 1987). از طرف دیگر بهبود باززایی گیاهان دارویی از طریق اندام زایی مستقیم با بهره گرفتن از ریزنمونه­های مختلف، می ­تواند کشت و زراعت گیاهان دارویی را ترفیع دهد و نیز از نظر حفاظت درون­شیشه ای، ناتوانی ذخیره بذر در بانک ژن به دلیل کاهش جوانه­زنی بذر را جبران کند. همچنین چرخه اصلاحی گیاهانی را که رشد کند دارند، تسریع کرده و تولید ژرم پلاسم­های عاری از پاتوژن را افزایش داده است (Zhang et al., 2011).
۱۰-۱- هدف از انجام تحقیق
با توجه به اهمیت گیاه مریم­گلی­کبیر و لزوم شناخت روش های تکثیری آن و همچنین شناخت بهترین، سریع­ترین و اقتصادی­ترین روش تکثیر آن در شرایط درون­شیشه ­ای، تحقیق حاضر به منظور تعیین بهترین ریزنمونه، ترکیب هورمونی و شرایط محیطی مناسب، جهت کشت درون­شیشه ­ای مریم­گلی­کبیر و همچنین تدوین دانش فنی کشت درون­شیشه ­ای آن در ایران انجام گرفته است. در انجام این پایان نامه، تکثیر این گیاه از طریق باززایی مستقیم با استفاده ازهورمونهای BAP، TDZ،Kin و IAA مورد بررسی و آزمایش قرار گرفت.
فصل دوم
بررسی منابع علمی

ریزازدیادی درون شیشه ­ای
ریزازدیادی درون­شیشه ­ای گیاهان، پتانسیل زیادی برای تولید داروها بر پایه گیاهان با کیفیت بالا دارد. ریزازدیادی فواید زیادی نسبت به روش های رایج ازدیاد رویشی دارد. با ریزازدیادی میزان تکثیر به مقدار زیادی افزایش می­یابد، همچنین باعث تولید مواد گیاهی عاری از پاتوژن می­ شود (Tripathi and Tripathi, 2003). ازدیاد کلونی توسط کشت بافت برای باززایی جمعیت گیاهان در سطح وسیع با ویژگیهای مشابه، مفید است (Lameira and Pinto, 2006).

اثرات نوع محیط کشت بر باززایی
فاکتورهای متعددی بر موفقیت تکثیر درون­شیشه ­ای گیاهان دارویی تأثیر می­گذارند. از مهمترین این فاکتورها، اثرات تنظیم­کننده­ های رشد نظیر اکسین و سیتوکینین بر روی شاخساره گیاهان دارویی مختلف می­باشد. نوع، غلظت و نسبت هورمونها در موفقیت کشت بافت مؤثر می­باشند. معمولاً به منظور ریشه­زایی از هورمونهای اکسینی، جهت شاخه­زایی از هورمونهای سیتوکینینی و برای تولید کالوس از نسبت­های متعادلی از این دو هورمون استفاده می­ شود (Sidhu, 2010). نتایج آزمایشات مختلف نشان داده که سیتوکینین جهت تکثیر شاخساره در بسیاری از ژنوتیپ­ها در غلظت مناسب مورد نیاز است، اما حضور غلظت­های کم اکسین در کنار سیتوکینین میزان تکثیر شاخساره را افزایش می­دهد (Shasany et al., 1998; Rout et al., 1999).
کشت کالوس از اپی­کوتیل و هیپوکوتیل (Miysaka et al., 1989; Waldemar. 1996) و نیز نوک شاخه (Morimoto et al., 1994) دانهال­های رشد­یافته درون­شیشه ­ای Salvia miltiorrhiza در محیط پایه MS جامد تکمیل­شده با ۵/۴ میکرومولار ۲,۴-D و ۵/۰ میکرومولار Kin (اپی­کوتیل و هیپوکوتیل) یا ۵/۲ میکرومولار IBA و ۳/۱ میکرومولار BA (نوک شاخه) با موفقیت انجام شد. Makung و Vanstaden (2008) برای S. africana-Lutea دستورلعمل کشت درون­شیشه ­ای را گسترش دادند. یشترین باززایی شاخه­ های نابجا در S. Officinalis در محیط MS تکمیل شده با ۲۲/۲ میکرومولار BAP و ۶۵/۴ و ۶۸/۲ میکرومولار NAA بدست آمد (Irina, 2008). در ازدیاد درون­شیشه ­ای S. brachyodon هورمون BAP در پیشرفت جوانه­های جانبی مؤثر بود و همه اکسین­های مورد آزمایش (IAA, IBA, NAA) ریشه­دهی شاخساره­های S. brachyodon را تحریک کردند (Misic et al., 2006). تولید شاخه­ های متعدد در Plantago ovate در محیط کشت حاوی ۶-۴ میکرومولار Kinهمراه با ۰۵/۰ میکرومولار NAA افزایش یافت (Barna and Wakhlu, 1988). Lal و Ahuja (1996) میزان پرآوری سریع در Picrorhiza kurroa با بهره گرفتن از Kin به میزان ۵-۱ میلی­گرم در لیتر را مشاهده کردند. Tatari Vernosefadrani و همکاران (۲۰۰۹) از تنظیم کننده­ های رشد مختلف برای ریزازدیادی Gerbera jamesonii استفاده کردند و نشان دادند که بیشترین پرآوری و طول گیاهچه­ها در محیط دارای ۲ میلی­گرم در لیتر Kin بدست آمد. BA در غلظت زیاد ( ppm5-1)، مریستم­های جانبی و نوک شاخه Atropa belladonna را تحریک می­ کند (Benjamin et al., 1987). بیشترین تولید شاخه از Nothapodytes foetida در محیط کشت دارای ۲/۲ میکرومولار TDZ بدست آمد (Rai, 2002). در گیاه ریحان (Ocimum basilicum) بیشترین میزان شاخه­زایی در محیط کشت MS تکمیل شده با ۵ میلی­گرم در لیتر BAP و ۲/۰ میلی­گرم در لیتر NAA بدست آمد (Bicca Dode et al., 2003) و بیشترین ریشه­زایی در محیط MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر NAA بدست آمد (Begum et al., 2002).
Arafeh و همکاران (۲۰۰۶) در آزمایشی که جهت تولید متابولیت­های ثانویه از گیاه مرزنجوش Origanum vulgare L.)) ترتیب داده بودند، برای القای کالوس، دیسک­های برگی را در سطوح مختلف ۲,۴-D (2، ۵/۱، ۱، ۵/۰، ۱/۰، ۰ میلی­گرم در لیتر) کشت کردند. حداکثر القای کالوس و وزن تر در مقادیر کمتر (۱/۰ یا ۵/۰ میلی گرم در لیتر) ۲,۴-D گزارش گردید.
در آزمایشی که بر روی گیاه در حال انقراض عنصل (Urginea maritime) برای تکثیر درون­شیشه ­ای با بهره گرفتن از دو ریزنمونه نوک شاخه و فلس پیاز صورت گرفت، مشخص شد که عموماً ریزنمونه­های نوک شاخه بهتر از فلس پیاز، به محیط کشت پاسخ دادند. بیشترین فراوانی پرآوری شاخه از ریزنمونه­های نوک شاخه در محیط MS تکمیل شده با ۴ میلی­گرم درلیتر NAA و همچنین ۲ یا ۴ میلی­گرم در لیتر BA گزارش شد. در ضمن بیشترین درصد کالوس­زایی و تشکیل ریشه در محیط MS تکمیل شده با ۸ میلی­گرم در لیتر NAA و ۲ میلی­گرم در لیتر BA بدست آمد (Saker et al., 1997).
در گیاه بادرنجبویه (Melissa officinalis) تشکیل شاخه از ریشه ­های ابتدایی در محیط کشت MS حاوی ۷۱/۵ میکرومولار IAA و ۶۶/۶ میکرومولار BA بدست آمد (Meszaros et al., 1999). در گیاه نعناع فلفلی بیشترین تعداد شاخه و طول شاخه در محیط MS تکمیل شده با ۴/۰ میلی­گرم در لیتر NAA و ۴/۰ میلی­گرم درلیتر Kin ثبت گردید (Venkatromalingam and Ebbie, 2011).
باززایی مستقیم گیاهچه از گل­آذین نر سیب­زمینی شیرین در محیط کشت MS بعلاوه ۹۴/۱۳ میکرومولار Kin نیز گزارش شده است (Borthakur and Singh, 2002).
در گیاه Ocimum sanctum بیشترین درصد تشکیل شاخساره (۹۰ درصد) و بیشترین تعداد شاخساره (۸۸/۵ شاخساره) از ریزنمونه­های نوک شاخساره کشت شده در محیط MS همراه با ۲/۰ میلی­گرم در لیترBAP حاصل شد. همچنین بیشترین میزان القای کالوس (۹۰ درصد) در محیط کشت پایه MS حاوی ۱/۰ میلی­گرم در لیتر NAA قابل مشاهده بود (Banu and Bari, 2007).
Gopi و همکاران (۲۰۰۶) گزارش کردند که در گیاه Ocimum gratissimum L. حداکثر تعداد شاخساره در محیط کشت MS حاوی ۵/۰ میلی­گرم در لیتر BAP و ۲۵/۰ میلی­گرم در لیترIAA ، ۴ هفته پس از کشت ریزنمونه­های گره، قابل مشاهده بود.
Uddin و همکاران در سال ۲۰۰۵ بیشترین تعداد شاخه در محیط کشت MS به همراه ۲میلی­گرم در لیتر Kin و ۵/۰ میلی­گرم در لیتر NAA را در گیاه Peltophorum pterocarpum بدست آوردند. در Crataeva magna تکثیر سریع در محیط کشت پایه MS به همراه ۸/۸ میکرومولار BAP بدست آمد (Benniaamin et al., 2004).
نوع سیتوکینین به کاررفته تأثیر عمده­ای، هم بر تعداد شاخساره­های القا­شده و هم بر کیفیت شاخساره­ها دارد. در کوتیلدون­های تیمارشده با Zeatin، مریستم­های جانبی کوتیلدون به طور عمده­ای توسعه یافتند، در حالی که در کوتیلدون­های تیمار شده با BAP و TDZ تشکیل جوانه­های نابجا از آن ناحیه اتفاق افتاد و تعداد زیادی شاخساره در هر کوتیلدون بدست آمد. در محیط کشت حاوی Zeatin، شاخساره­ها رشد زیادی داشتند. TDZ بیشترین تعداد شاخساره را تولید نمود ولی این شاخساره ها بسیار کوچک بودند (Neves et al., 2001).
اصغری و همکاران (۱۳۸۹) نشان دادند که در بین ریزنمونه­های مختلف در گیاه ریحان (Ocimum basilicum) پدیده شیشه ­ای شدن فقط در ریزنمونه کوتیلدون و در غلظت­های ۱/۱ و ۲/۲ میلی­گرم در لیترهورمون BA در محیط MS رخ داد. غلظت­های زیاد BAP (5 میلی­گرم در لیتر) در کشت بافت فیلودندرون و موز منجر به شیشه ­ای شدن بافت­ها شد (Vardja and Vardja, 2001).
۳-۲- اثرات نوع ریزنمونه بر باززایی
انواع مختلف ریزنمونه، نتایج متفاوتی در کشت بافت نشان دادند. در گیاه مریم­گلی­کبیر Salvia sclarea باززایی از ریزنمونه­های کوتیلدونی بدست آمد (Wennuan et al., 2000). در گیاه بادرنجبویه Melissa officinalis باززایی از ریزنمونه نوک شاخه در محیط MS همراه با هورمونهای NAA و BAP بهتر صورت گرفت (Meftahizade et al., 2010). در آزمایشی که بر روی باززایی مستقیم شاخه از گیاه نعناع فلفلی (Mentha piperita) با بهره گرفتن از ریزنمونه­های مختلف (مریستم شاخه، گره، میانگره و دمبرگ) انجام گردید، تعداد شاخه بدست آمده از ریزنمونه­های مختلف متفاوت بود. بیشترین باززایی شاخه در ریزنمونه گره در محیط کشت MS½ همراه با ۵/۱ میلی­گرم در لیترBAP گزارش شد (Sarwar et al., 2009). همچنین موفقیت باززایی از قطعات گرهی و نوک شاخه در نعناع فلفلی توسط Ghanti و همکاران (۲۰۰۳) گزارش شد. Akbas و همکاران (۲۰۱۱) گزارش کردند که بیشترین تشکیل شاخه با بهره گرفتن از ریزنمونه­های برگ در محیط MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر BAP و ۱ میلی­گرم در لیتر Kinبدست آمد.
در گیاه Ocimum basilicum باززایی شاخساره از ریزنمونه­های گره­های جانبی در محیط کشت پایه MS همراه با ۵/۰ میلی­گرم در لیتر IAA و ۵/۰ میلی­گرم در لیتر BA بدست آمد (Daniel et al., 2010). در گیاه Ocimum kilimandscharicum حداکثر تعداد شاخه از ریزنمونه­های گره­های جانبی در محیط کشت MS همراه با ۱ میلی­گرم در لیتر BA بدست آمد (Saha et al., 2010). در گیاه Ocimum tenuiflorum باززایی غیرمستقیم از ریزنمونه­های جوانه­های جانبی در محیط کشت MS همراه با هورمونهای Kin, BAP, NAA, IAA بدست آمد (Gogoi and kumaria, 2011).
Chen و همکاران (۲۰۰۱)، تشکیل شاخه­ های نابجا از ریزنمونه­های میانگره ساقه گیاه دارویی مهم Adenophora triphylla را گزارش کردند. باززایی از ریزنمونه­های نوک شاخه و گره در گیاه Bixa orellana L. در محیط کشت MS همراه با ۲-۱ میلی­گرم در لیتر ۲-ip گزارش شد (Sharon and D,sauza, 2000). تشکیل جوانه­های جانبی بر روی قطعات گره ساقه Lxora fulgens در محیط کشت MS همراه با NAA (1/0 میلی­گرم در لیتر) + BA (5/0 میلی­گرم در لیتر) امکان­ پذیر می­باشد (Amin et al., 2002).
لازم به ذکر است که باززایی مستقیم درون­شیشه ­ای، برای بسیاری از گیاهان دارویی مهم با بهره گرفتن از ریزنمونه­های مختلف گزارش شده­است. به عنوان­ مثال در رزماری (Rosmarinus officinalis L.) از قطعات گره (Misra and Chaturredi, 1984)، در پونه (Mentha spp) از جوانه­های جانبی (Rech and Piers, 1986)، در گل انگشتانه (Digitalis lanata) از انتهای شاخساره (Erdei et al., 1981)، در داتوره (Datura insignis) از گره ساقه (Cantrell et al., 2001)، در شقایق روغنی (Papaver somniferum) از هیپوکوتیل (Nessler, 1982)، درگل راعی (Hypericum spectabile) از ریزنمونه­های برگ (Akbas et al., 2011) و در نوعی ریحان (Ocimum gratissimum L.) از ریزنمونه­های گره (Gopi et al., 2006).
نتایج مطالعات علیزاده (۱۳۹۰) نشان داد که در بین ریزنمونه­های مختلف (گره، مریستم انتهایی، هیپوکوتیل و کوتیلدون) گیاه زوفا Hyssopus officinalis L. حداکثر میانگین باززایی شاخساره، در محیط MS حاوی ۲/۲ میکرومولار BAP در ریزنمونه گره قابل مشاهده می­باشد. ریزنمونه­های هیپوکوتیل و کوتیلدون باززایی نشان ندادند.
۴-۲- ریشه زایی
اکثر گیاهان برای باززایی مؤثر ریشه به اکسین نیازمندند. برای ریشه­دهی گیاهان علفی اغلب از اکسین ضعیف (IAA) در غلظت­های بین ۱۰- ۱/۰ میلی­گرم در لیتر استفاده می­ شود. گیاهان چوبی نسبت به گیاهان علفی، به غلظت بالاتر اکسین نیازمندند. بهترین اکسین­های مؤثرIBA در غلظت­­های بین ۳- ۵/۰ میلی­گرم در لیتر و NAA در غلظت­ های بین ۱- ۰۵/۰ میلی­گرم در لیتر هستند (Edwin and Paul, 1984).
تشکیل ریشه در گل راعی (Hypericum perforatum) از شاخه­ های حاصل شده از کالوس در محیط MS دارای ۴ میلی­گرم در لیتر IAA بدست آمد،IAA و IBA به طور مساوی برای القاء ریشه مؤثر بودند (Goel et al., 2009).
در گیاه Ocimum kilimandscharicum ریشه­زایی از شاخه­ها در محیط کشت MS ½ همراه با ۵/۱ میلی­گرم در لیتر IBA بدست آمد (Saha et al., 2010; Daniel et al., 2010).
در گیاه Ocimum tenuifolorum بهترین ریشه­زایی در محیط کشت MS همراه با ۸۲/۲۶ میکرومولار NAA و ۳۲/۲ میکرومولار بدست آمد (Gogoi and Kumaria, 2011).
در گیاه اسطوخودوس فرانسوی (Lavandula angustifolia) ریشه­زایی در محیط کشت MS همراه با ۴/۰ میلی­گرم در لیتر NAA یا IBA بدست آمد (Al-Bakhit et al., 2007).

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...