حفظ و تکثیر SSC ها و القای اسپرماتوژنز در شرایط in vitro همچنین می تواند به عنوان یک استراتژی درمانی برای درمان ناباروری در مردانی باشد که در معرض اشعه درمانی یا شیمی درمانی بوده و یا ضایعات نخاعی امکان تکثیر SSC و ورود به فاز میوز را در آنها مختل کرده است(Radford et al., 1999). هدف این تحقیق، بررسی بافت بیضه بیماران مختلف و استحصال سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی از بیضه افراد نابارور مدل آزواسپرمیا و تکثیر آنها و پیدا کردن روشهای مناسب جهت تمایز و برطرف کردن نقص های توقف تقسیم می باشد. اسپرماتوژنز یک فرایند پیچیده و پویا می باشد که در آن اسپرماتوگونی دیپلوئید تحت 10 تقسیم میتوز و دو تقسیم میوز تبدیل به اسپرماتوزای هاپلوئید می گردد (Russell, 1990) . این فرایند از بلوغ شروع شده و تا پایان عمر ادامه می یابد. در موش 35 روز و در انسان 64 روز به طول می انجامد (Brinster, 2002). سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی پتانسیل بی نظیری برای خود نوسازی و تولید سلولهای دختر تمایز یافته دارند (Oatley&Brinster, 2006). این سلولها بسیار منحصر به فرد هستند چراکه تنها سلول در بدن هستند که می توانند ژنها را به نسل بعد از خود منتقل کند (Brinster&Nagano,1998 ). سلولهای زاینده که وارد مرحله میوز می شوند به وسیله سلولهای سرتولی محافظت می شوند. این سلولها به سمت لومن لوله های منی ساز پیشرفت می کنند و نهایتا به اسپرم بالغ تبدیل شده و به داخل لوله ها رها می شوند (Brinster&Zimmermann, 1994).

 

 

عوامل زیادی مانند فاکتور های رشد، هورمون ها، تعامل بین سلولهای سرتولی و سلولهای ژرم فرایند اسپرم زایی را تحت تاثیر قرار می دهند. نقص در هر یک از این عوامل می تواند منجر به ناباروری شود (Brinster&Nagano, 1998).

 

 

در شرایط محیط کشت سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی تنها سلولهایی هستند که قادر به ایجاد کلنی هستند. در سیستم های کشت بدون سرم توانایی زنده ماندن آنها کاهش می یابد و در طی چند روز همه می‌میرند Kanatsu- shinohara et al., 2003. افزودن سرم و نگهداری سلولهای زاینده بر روی لایه تغدیه کننده درصد زنده ماندن آنها را افزایش می دهد همچنین افزودن سایتوکین ها و فاکتورهای رشد باعث بهبود محیط کشت و در نتیجه تکثیر وزنده ماندن این سلولها می شود. در تحقیقات اخیر استفاده از نانو فایبر در محیط کشت و تکثیر سلولهای بنیادی بر روی آنها به دلیل شباهت مورفولوژیکشان به ماتریکس خارج سلولی, بر روی سلولهای بنیادی جنینی و استخوانی مورد بررسی قرار گرفته است .

 

 

در این مطالعه تمایز سلول های بنیادی اسپرماتوگونی در شرایط vitro in در حضور و یا عدم حضور نانوفایبر PLLA و دوزهای مختلف Bmp4 و رتینویک اسید مورد بررسی قرار می گیرد. برای این منظور سلولهای SSC و سرتولی سل از بیضه افراد که آزواسپرمی غیر انسدادی دارند با روش هضم آنزیمی دو مرحله ای به دست آمده و بر روی پلیت های کشتی تکثیر می شوند. پس از گذشت سه هفته از کشت اثرات PLLA، رتینوئیک اسید و BMP4روی تمایز کلونیهای SSC به وسیله مشاهدات میکروسکوپی , تکنیک ایمنوسیتوشیمی و نیز بیان ژنهای میوتیک SCP3 و پست میوتیک ACR با استفاده از RT-PCR مورد بررسی قرار می گیرد. نتایج حاصل مورد بررسی آماری و بیوانفورماتیکی قرار خواهد گرفت.

 

 

1-2- ویژگی های کلی سلول های بنیادی

 

 

سلولهای بنیادی سلولهایی هستند که با پتانسیل تمایز به انواع دیگر سلولها و قدرت تقسیم نامحدود شناخته می شوند سلولهای بنیادی دارای دو منشا جنینی و بزرگسالان هستند. سلولهای بنیادی با منشاء مختلف از لحاظ پتانسیل تکثیر و تمایز با یکدیگر متفاوت هستند به طوری که این پتانسیل از سلولهای بنیادی جنینی به سمت سلولهای بنیادی بزرگسال کاهش می یابد. سلولهای بنیادی جنینی از توده سلولی داخلی جنین در مرحله بلاستوسیت بدست می آیند و سلولهای بنیادی بزرگسال از بافتهای تخصص یافته مختلف مانند مغز، مغزاستخوان، کبد، پوست، لوله گوارش، قرنیه و شبکیه چشم و نیز پالپ عاج دندان بدست می آیند. این سلولها در بزرگسالان به طور مداوم فعال هستند. در ابتدا محققین بر این باور بودند که سلولهای بنیادی بزرگسالان تنها سلولهای همان بافت را ایجاد می کنند اما امروزه اعتقاد بر این است که این سلولها توانایی تبدیل شدن به انواع مختلف سلولها را دارند. به عنوان مثال سلولهای بنیادی بزرگسال مشتق از مغز استخوان علاوه بر آنکه می توانند سلولهای خونی و ایمنی را بسازند قادرند به طور مستقیم به انواع دیگری از سلولها نظیر سلولهای ماهیچه اسکلتی، میکروگیلیا و آستروگیلیا در مغز و هپاتوسیهای کبدی نیز تمایز یابند . بر این اساس پیشنهاد شده که این سلولها می توانند در پزشکی مفید باشند (Smith, 2001).

 

 

 

 

 

1-2-1- تقسیم بندی سلول های بنیادی

 

 

بر اساس یک تعریف سلولهای بنیادی را می توان به سه گروه تقسیم بندی کرد: همه توان، پرتوان و چند توان (Wagers&Weissman, 2004). سلولهای بنیادی همه توان (Totipotent) می توانند همه ی انواع سلولهای جنین را به وجود آورند که شامل سلولهای رویانی و جفتی می شوند. در واقع این سلولها پتانسیل نامحدود دارند و می توانند یک موجود زنده کامل را ایجاد کنند. مانند بلاستومرهای یک جنین دو سلولی که هر سلول آن می تواند یک فرد کامل را بسازد. سلولهای پر توان(Ploripotent) نمی توانند یک جنین کامل را شکل دهند اما می توانند سلولهای هر سه لایه جنینی را که شامل اندودرم، مزودرم و اکتودرم می شوند را ایجاد کنند.

 

 

سلولهای چند توان (Moltipotent) توانایی ایجاد محدوده کوچکی از سلولها وبافتها رادارند. مانند سلولهای بنیادی واقع در بافتهای بزرگسالان .

 

 

سلولهای بنیادی پلوری پوتنت دارای 5 کلاس مختلف هستند که عبارتند از :

 

 

1) سلولهای بنیادی جنینی

 

 

2)سلولهای بنیادی زایا    (Shamblott et al., 1998)

 

 

3)سلولهای بنیادی زایای چند توان

 

 

4)سلولهای کارسینومای جنینی (Solter et al., 1970)

 

 

5) سلولهای بنیادی بالغ چند توان که مغز استخوان را تشکیل می دهند(Wagers&Weissman, 2004).

 

 

 

 

 

1-2-1-1- سلولهای بنیادی جنینی ESc))

 

 

سلولهای بنیادی جنینی Esc) ) از توده سلولی داخلی بلاستوسیتهای پستانداران مشتق می شوند و از نظر عملکردی معادل بلاستومرهای

 توده داخلی هستند. تولید سلولهای بنیادی جنینی انسانی برای اولین بار در سال 1998 میلادی توسط تامسون و همکارانش گزارش شد (Thomson et al., 1998). آستین اسمیت که مطالعات فراوانی را بر سلولهای بنیادی جنینی موشی انجام داده است مشخصات زیر را برای آنها ضروری می داند:

 

 

از توده سلولی داخلی ( ICM ) یا اپی بلاست بلاستوسیت مشتق شده باشد.

 

 

– توان خود نوزایی در بلند مدت داشته باشند. یعنی دارای توان تقسیم متقارن نامحدود و بدون تمایز باشند و در عین حال توان تمایزی را حفظ کنند.

 

 

-دارای کاریوتیپ طبیعی کروموزمی باشند و این حالت را نیز حفظ کنند.

 

 

– بتوانند انواع سلولهای تمایز یافته که مشتق از سه لایه جنینی (اندودرم ، مزودرم و اکتودرم) است را به وجود آورند

 

 

–   توان ادغام در تمام بافتهای جنینی را داشته باشند .

 

 

– دارای توان تولید دودمان زاینده که در نهایت اسپرم و تخمک را به وجود می آورند باشند.

 

 

–   دارای توان کلنی زایی باشند.

 

 

– غیر فعال شدن کروموزم X در سلولهای بنیادی جنینی رخ نمی دهد .

 

 

– سولهای بنیادی جنینی فاقد نقطه کنترل G1 هستند و بیشتر زمانشان را در فاز S به سر می برند.

 

 

–   بیان فاکتور نسخه برداری Oct-4. این فاکتور سبب تحریک یا مهار دسته جمعی ژنها می شود که سلولهای بنیادی جنینی را در حال تکثیری و غیر تمایزی نگه می دارد .

 

 

از جمله مزایای سولهای بنیادی جنینی نسبت به سولهای بنیادی بزرگسالان توانایی تقسیم نا محدود این سلولها در شرایط آزمایشگاهی و توانایی تمایز گسترده آنهاست (Smith, 2001) . این سلولها تاکنون تنها از سه گونه پستانداران اعم از موش ، میمون و انسان با توان خود نوزایی و کشت طولانی مدت بدست آمده است (Reubinoff et al., 2000).

 

 

حالت همه توانی یا پرتوانی سلولها با بیان سه عامل رونویسی هسته ای یعنی OCT4,، Stat3 ، Nanog مرتبط است . OCT4 در هسته بلاستومرهای حاصل از تسهیم اولیه بیان می شود، اما بیان آن به توده سلولی داخلی(ICM) محدود می گردد ودرطی گاسترولاسیون در آن دسته از سلولهایی که تصور می شود تبدیل به سلولهای زایای بدوی خواهند شد بیان می شود (Yeom et al., 1996).

 

 

Nanog عامل رونویسی دیگری است که در سلولهای پرتوان بلاستوسیت موش یافت می شود، بیان آن در PGC های جنین های موشی به میزان زیادی دیده شده است این ژن در بقای پرتوانی سلولهای بنیادی ضروری است(Hatano et al., 2005).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1-2-1-2– سلولها بنیادی زایا EGc) )

 

 

اگر سلولهای زایای اولیه ( ( PGC کشت داده شوند کلونی هایی شبیه سلولهای ESc تولید می کنند. در داخل بدن هنگام مهاجرت سلولهای PGC ، عامل سلولهای بنیادی (SCF) تکثیر آنها را افزایش می دهد و این تکثیر می تواند با افزودن عامل رشد دیگری به نام LIF افزایش یابد. طول عمر این سلولها بسیار کوتاه است و زود می میرند ولی با افزودن عامل رشد فیبروبلاستی (FGF ) به تکثیر ادامه می دهند و سلولهای بنیادی زایای پرتوانی باخصوصیات شبیه به سلولهای توده سلولی داخلی تولید می کنند. این سلولهای مشتق از PGCها سلولهای زایای جنینی (EGc) نامیده می شوند و دارای پتانسیل لازم برای تمایز به همه انواع سلولهای بدن هستند(Matsui et al., 1992).

 

 

 

 

 

1-2-1-3- سلولهای کارسینومای جنینیECc) )

 

 

سلولهای کارسینومای جنینی سلولهای تمایز نیافته با خاصیت خود نوزایی هستند که از تراتو کارسینوماها (تومورهای بدخیم غدد جنسی) که حاوی سلولهای تمایز یافته هر 3 لایه زاینده هستند مشتق می شوند . تراتوکارسینوما چه به صورت خود به خودی تولید شوند چه به صورت آزمایشی، شامل جمعیتی از سلولهای بنیادی تمایز نیافته با مشخصات بیوشیمیایی و تکوینی مشابه توده سلولی داخلی است (Parsons et al., 2004) .این سلولها که بنیادی محسوب می شوند نه تنها تقسیم می شوند بلکه می توانند به انواع گسترده ای از بافتها مانند اپی تلیوم روده ، اپی تلیوم تنفسی، ماهیچه ،عصب، غضروف و استخوان نیز تمایز یابند. این سلولهای بنیادی پرتوان تمایز نیافته سلولهای کارسینومای جنینی (ECc) نامیده می شوند. سلولهای بنیادی تراتوکارسینوما از تکوین اولیه ی پستانداران تقلید می کنند اما این تکوین به صورت اتفاقی وآسیب رسان است(Kahan&Ephrussi, 1970) .سلولهای کارسینومای جنینی انسان (hEC) برای اولین بار از تومورهای مشتق از جرم سل شناسایی شدند . hEC می توانند در شرایط آزمایشگاهی چندین رده سلولی مختلف را به وجود آورند. این تومورها بیشتر منشا آنوپلوئیدی دارند که آنها را برای سلول درمانی نامناسب می کند.

 

 

 

 

 

1-2- 1-4 سلولهای بنیادی زایای چند توان mGCs) )

 

 

نوع دیگری از سلولهای بنیادی پر توان سلولهای mGCs هستند که از بیضه موشهای بالغ و نوزاد جدا شده اند. این سلولها از لحاظ مورفولوژی شبیه به سلولهای ESc موش هستند که مارکرهای خاص سلولهای ESc موشی را نیز بیان می کنند و به دودمانهای چند گانه در محیط in vitro تمایز می یابند. با این حال سلولها ی mGCs از لحاظ اپی ژنتیکی از هردو نوع سلول ESc وEGc متمایز هستند. بیضه موش شامل زیر جمعیتهای مختلف از سلولهای بنیادی زایا می باشد . منشا mGCs تا به امروز به طور کامل مشخص نشده است (Koruji et al., 2007).